Biogipuzkoa Osasun Ikerketa Institutuko Neuroimmunologia taldeak aztertu du DNA eta RNA zirkularrak modu fidagarrian detektatzeko laborategiko eta konputazioko estrategiarik onena zein den. Aitor Zabala, Alex Martinez Ascensión eta David Otaegui ikertzaileek, Iñigo Prada-Luengorekin (Center for Genomic Medicine Rigshospitalet Copenhagen University Hospital) batera, egin dute lan hori, eta GigaScience nazioarteko aldizkari zientifikoan argitaratu dira emaitzok.
DNA zirkularra (eccDNA) eta RNA zirkularra (circRNA) tamaina desberdineko molekulak dira, eukariotoetan ohikoak direnak eta hainbat zelula eta ehunetan ugariak izatera iristen direnak. Hainbat gaixotasunekin erlazionatuta direnez, etorkizun handiko biomarkatzaile gisa proposatu dira. Hala ere, detektatzeko erabiltzen diren tresna informatikoek oso emaitza desberdinak ematen dituzte eta positibo faltsu asko sortzen dituzte. Beraz, lan honen helburua izan zen detekzio-tresna horiek sistematikoki alderatzea, datu simulatuekin zein errealekin, eta tresnak konbinatzeko estrategia bat proposatzea, detekzioen fidagarritasuna hobetzeko.
Ikerketa berri honetan, zirkuluen detekzioa iragaztea funtsezkoa dela ikusi zen, hasieran lortzen diren asko zarata direlako, hau da, detekzio faltsuak. Iragazki sinpleak aplikatzean (adibidez, zirkulu bat gutxienez hainbat aldiz sekuentziatzea) eta molekula horiek espezifikoki aberasten dituzten laborategiko teknikak erabiltzean (molekula mota horien kopurua handitzea), arazo hori argi murrizten da. Gainera, ikertzaile-taldeak barne-adierazle berri bat proposatzen du, ∆CJ deitutakoa, irakurketak (sekuentziatutako DNA puskak) lotura zirkularrean modu orekatuan banatzen diren neurtzen duena eta, horrela, fidagarritasun gutxiko iragarpenak seinalatzen dituena. Azkenik, frogatu zuten gutxienez hiru tresna konbinatzeak eta tresna horietako bik edo gehiagok (Rossete estrategia deiturikoa) detektatutako zirkuluekin bakarrik geratzeak askoz ere katalogo sendoagoa eta erabilgarriagoa eskaintzen duela etorkizuneko oinarrizko azterketetarako eta azterketa klinikoetarako.
Emaitza horietan oinarrituta, ikerketa honetan lau ondorio nagusi atera ziren. Lehenik eta behin, datuak iragazi beharra: iragazi gabe, zirkuluen “detekzio” asko zarata dira; lotura zirkularra gurutzatzen duten gutxieneko irakurketak eskatzeak asko hobetzen du zehaztasuna. Bigarrenik, estaldurak (zirkulu bat sekuentziatzen diren aldiak) eta laborategiko protokoloak garrantzia dute: estaldura moderatuak (ez nahitaez altuak) eta eccDNA/circRNA espezifikoki aberasten duten metodoak (Circle-Seq deitua, non RNase erabiltzen den sekuentzia linealak ezabatzeko), hurbilketa orokorrak baino emaitza fidagarriagoak ematen dituzte, hala nola ATAC seq edo RNA seq metodo estandarrak. Hirugarrenik, ∆CJ adierazle berria kalitatezko termometro on bat da: adierazle honek, loturaren bi aldeetako irakurketen orekan oinarrituta, zirkulu susmagarriak identifikatzen laguntzen du, batez ere datu biologikoetan, non ez dagoen erreferentzia gisa balio duen informazio zehatz eta egiaztaturik, Ground Truth (“egia lurrean”) bezala ezagutzen den fenomenoa. Azkenik, konbinazioan hobeto bereizita baino: gutxienez hiru tresna erabiltzea eta bi edo gehiagok partekatzen dituzten zirkuluekin bakarrik geratzeak (Rosette estrategia) oreka onena eskaintzen du zirkulu nahikoak detektatzearen eta positibo faltsuak saihestearen artean, eta, beraz, ikerketa-taldeak hurbilketa hau gomendatzen du etorkizuneko ikerketetarako.
Lan honek klinikaren maneiuan zuzenean eragiten ez badu ere, ikerketaren kalitatea hobetu dezake, eta, epe ertainean, klinikara iritsiko dena. Hobeto bereizten laguntzen duenez zer DNA eta RNA seinale zirkular diren errealak eta zein diren zarata, errazagoa da etorkizuneko ikerketek biomarkatzaile fidagarriagoak identifikatzea diagnostiko goiztiarrerako, pronostikorako edo tratamenduen monitorizaziorako. “Erabilera-gida” bat ere eskaintzen du, jakiteko zer baldintza esperimental eta tresna-konbinazio diren seguruenak, eta horrek murriztu egiten du erabaki edo entsegu klinikoak oinarritzea okerreko emaitzetan. Oro har, horrek aukera gehiago ematen ditu balidatzen diren eccDNA eta circRNAn oinarritutako biomarkatzaileak benetan erabilgarriak eta erreproduzigarriak izateko pazienteentzat.
Ikertzaile-taldeak aitortu duenez, “pozik gaude eta, batez ere, lasaitu ederra hartu dugu ordena pixka bat jartzeagatik eremu batean non tresna bakoitzak ‘bere egia’ ematen zuen eta zaila zen jakitea zertaz fidatu. Oso lan teknikoa eta luzea izan da, baina arazo oso praktiko bat konpontzen ari ginelako sentsazioarekin, gure egunerokoan datuak aztertzen ere pairatu genuena“. Gaineratu dutenez, “emaitzek ibilbide-orri gisa balio izatea espero dugu: beste talde batzuek beren esperimentuak hobeto diseinatu ahal izatea, arrazoizko estaldurak eta protokoloak aukeratzea, eta lanabesen eta iragazkien konbinazioak erabiltzea positibo faltsuak murrizteko, seinale erabilgarria galdu gabe. Eta, funtsean, ideia da horrek guztiak DNA eta RNA zirkularretan oinarritutako etorkizuneko biomarkatzaileak sendoagoak, erreproduzigarriagoak eta laguntzea, egunen batean, pazienteentzat benetan baliagarriak izan daitezen“.
