El grupo Neuroinmunología del Instituto de Investigación Sanitaria Biogipuzkoa, ha analizado cuál es la mejor estrategia de laboratorio y computacional para detectar de manera fiable ADN y ARN circulares. Les y los investigadores Aitor Zabala, Alex Martinez Ascensión y David Otaegui, junto a Iñigo Prada-Luengo (Center for Genomic Medicine Rigshospitalet Copenhagen University Hospital), han realizado este trabajo, cuyos resultados se han publicado en la revista científica internacional GigaScience.
El ADN circular (eccDNA) y el ARN circular (circRNA) son moléculas de tamaño diverso que son comunes en las eucariotas y llegan a ser abundantes en varios tipos de células y tejidos. Al haberse relacionado con varias enfermedades, se han propuesto como biomarcadores prometedores. Sin embargo, las herramientas informáticas que se usan para su detección dan resultados muy distintos y generan muchos falsos positivos. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue comparar sistemáticamente dichas herramientas de detección, tanto con datos simulados como reales, y proponer una estrategia de combinación de herramientas que mejore la fiabilidad de las detecciones.
En este nuevo estudio, se observó que filtrar la detección de círculos es crucial, porque muchos de los que se obtienen inicialmente son en realidad ruido, es decir, detecciones falsas. Al aplicar filtros sencillos (por ejemplo, que haya un mínimo de veces que se haya secuenciado un círculo) y al usar técnicas de laboratorio que enriquecen específicamente estas moléculas (aumentan el número de este tipo de moléculas), este problema se reduce de forma clara. Además, el grupo investigador propone un nuevo indicador interno, llamado ∆CJ, que mide si las lecturas (pedacitos de ADN secuenciados) se reparten de forma equilibrada en la unión circular y así señalar predicciones poco fiables. Por último, demostraron que combinar al menos tres herramientas y quedarse solo con los círculos detectados por dos o más de estas herramientas (la llamada estrategia Rossete) proporciona un catálogo mucho más robusto y útil para futuros estudios básicos y clínicos.
Tomando como base estos resultados, en este estudio se llegó a cuatro conclusiones principales. Primero, la necesidad de filtrar los datos: sin filtrado, muchas “detecciones” de círculos son ruido; exigir un mínimo de lecturas que crucen la unión circular mejora mucho la precisión. Segundo, la cobertura (veces que se secuencia un círculo) y el protocolo de laboratorio importan: coberturas moderadas (no necesariamente altas) y métodos que enriquecen específicamente eccDNA/circRNA (llamado Circle-Seq, donde se usa la RNase para eliminar secuencias lineales) dan resultados más fiables que aproximaciones generales como son los métodos ATAC‑seq o RNA‑seq estándar. Tercero, el nuevo indicador ∆CJ es un buen termómetro de calidad: este indicador basado en el equilibrio de lecturas a ambos lados de la unión ayuda a identificar círculos sospechosos, sobre todo en datos biológicos donde no hay información precisa y verificada que sirva como referencia, fenómeno conocido como Ground Truth (“verdad terreno”). Por último, mejor en combinación que por separado: usar al menos tres herramientas y quedarse solo con los círculos compartidos por dos o más (estrategia Rosette) ofrece el mejor equilibrio entre detectar suficientes círculos y evitar falsos positivos, por lo que el grupo de investigación recomienda esta aproximación para futuros estudios.
Aunque este trabajo no impacta directamente el manejo clínico, sí puede mejorar la calidad de la investigación que, a medio plazo, acaba llegando a la clínica. Al ayudar a distinguir mejor qué señales de ADN y ARN circulares son reales y cuáles son ruido, facilita que futuros estudios identifiquen biomarcadores más fiables para diagnóstico temprano, pronóstico o monitorización de tratamientos. También ofrece una “guía de uso” sobre qué condiciones experimentales y combinaciones de herramientas son más seguras, lo que reduce el riesgo de basar decisiones o ensayos clínicos en resultados erróneos. En conjunto, esto aumenta las probabilidades de que los biomarcadores basados en eccDNA y circRNA que lleguen a validarse sean realmente útiles y reproducibles para las y los pacientes.
El grupo investigador reconoce que “nos sentimos satisfechos y, sobre todo, aliviados de poner un poco de orden en un campo donde cada herramienta daba ‘su verdad’ y era difícil saber en qué confiar. Ha sido un trabajo muy técnico y largo, pero con la sensación de que estábamos resolviendo un problema muy práctico que también sufrimos en nuestro propio día a día analizando datos”. Añaden que “esperamos que los resultados sirvan como hoja de ruta: que otros grupos puedan diseñar mejor sus experimentos, elegir coberturas y protocolos razonables, y usar combinaciones de herramientas y filtros que reduzcan falsos positivos sin perder señal útil. Y, de fondo, la idea es que todo esto ayude a que los futuros biomarcadores basados en ADN y ARN circulares sean más sólidos, reproducibles y, algún día, realmente útiles para las y los pacientes”.
